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本试剂盒是整合可视化LAMP和荧光染料LAMP而成的产品，它既可以用于荧光染料法LAMP扩增及检测，也可以用于可视化LAMP扩增及检测，适用于各种针对核酸的快速定性检测。

• 65℃恒温扩增，不需要贵重的仪器设备，只需要恒温水浴或金属浴。
  
• 一般60分钟内出结果（具体时间取决于靶分子的浓度）。
  
• 最大样品加样量高达到14μL（对20μL的反应体系），减少了漏检机率。
  
• 含可视化染料和荧光染料，故既可以用肉眼终点判断结果（终点法可视化LAMP），也可用荧光PCR仪进行实时荧光检测（实时荧光LAMP）。
  
• 灵敏性可达10拷贝/反应以下（跟引物设计密切相关），故假阴性率更低。
  
• 只能进行定性检测，不建议用于定量检测。
  
• 本制品足够50次20μL体系的荧光及可视化LAMP扩增。
  
• 本制品只能用于科研。

1. 用自选方法纯化样品DNA，本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的各种免提取的核酸释放剂。
   
2. 如果有N个样品，则至少需要做N+2个样品制备，多出的两个一个是样品制备阳性对照（制备时加入自备的、跟要检测的靶分子相同的阳性对照模板，一起经历提取过程）和一个样品制备阴性对照（用水替代样品）。最后N+2个样品一起进行DNA提取操作，得到N+2个DNA样品。

3. 用超纯水将自备的6种（或4种）LAMP引物干粉分别稀释到100μM，然后按下表配制100μL的20×LAMP引物混合液，此混合液足够100次20μL体系的LAMP扩增。如果需要配制的引物混合液体积异于100μL，则各成分的用量需按比例调整。引物混合液可以在-20℃放置2年。
   

   引物名称	母液浓度	配制100μL 混合液所需量	在20×LAMP引 物混合液中的浓度
   FIP引物	100μM	32μL	32μM
   BIP引物	100μM	32μL	32μM
   F3引物	100μM	4μL	4μM
   B3引物	100μM	4μL	4μM
   Loop F	100μM	8μL	8μM
   Loop B	100μM	8μL	8μM
   自备超纯水		12μL

   注意：如果设计的LAMP引物不含Loop引物，则按上表配制时Loop引物用超纯水替代，使得总体积为100μL。
   
4. 测试引物的专一性：用qPCR仪器做加模板和不加模板（至少1000拷贝/反应）的荧光LAMP反应，测试每套LAMP引物的专一性。无模板反应的Ct值比有模板反应的Ct值相差越大，LAMP引物的非特异扩增就越低，专一性就越强。用户需要根据每套LAMP引物的测试结果设定该套LAMP阴性和阳性的阈值（本制品只用于定性）。如果没有qPCR仪器，只能用肉眼检测法来筛选引物，则扩增1小时后加模板的反应呈现蓝色，不加模板的反应呈现淡蓝色的引物，就可以使用。扩增后都呈现蓝色的引物，有非特异扩增，不能使用。都呈现淡蓝色的引物，没有扩增，也不能使用，上述两种情况均需要重新设计。

5. 预先将保温设备调到65℃。
   
6. 反应设置：第一次使用时请把所有Bst酶（50μL，本试剂盒提供）加入到4×LAMP MasterMix(双染料)中，轻柔颠倒20次充分混匀，然后再取用。如果有N+2个DNA纯化样品，则最好设置N+5个LAMP扩增，增加扩增阳性对照、无模板阴性对照、无引物无模板阴性对照各1个。在N+5个0.2mL的PCR管中按下表加入下列成分：
   

   成分	N+2个样品管	无模板阴性对照管	扩增阳性对照管
   4×LAMP MagicMix(已加酶)	各5μL	5μL	5μL
   自备20×引物混合液	各1μL	1μL	-
   自备的N+2个样品DNA	1～14μL	-	-
   LAMP阳性对照模板-引物混合物	-	-	4μL
   超纯水	20μL	20μL	20μL

   
   
7. 如使用金属浴、水浴或普通无热盖PCR仪，则每管再加50μL自备石蜡油。
   如不加石蜡油，保温期间水分会蒸发，非特异扩增会增加。如果使用带热盖的PCR仪器，则不需要加石蜡油。
   
8. 立即放到65℃并保温90分钟。如果使用荧光定量PCR仪：聚合温度设为65℃，1次循环1分钟，90个循环，每分钟在FAM通道采集一次荧光信号。

9. 扩增结束后肉眼观察结果判断阴性和阳性。典型的结果见下图：左边管为阴性，右边两个管为阳性。
   
   
10. 结果分析：如果本试剂盒提供的阳性对照-引物混合物呈现阳性而阴性对照为阴性，则实验有效。如果阳性对照-引物混合物呈现阴性，则操作有问题或者试剂盒有问题，请跟厂家联系。如果阴性对照（水作为模板）也呈现阳性，则说明LAMP样品或试剂有过去的扩增产物的污染，需要注意操作的规范性，如果不能解决，可以重新设计引物扩增新的靶片段。

11. 结果分析：实验有效性判定。如果两个阳性对照能够得到标准的S型扩增曲线而两个阴性对照都没有扩增，则实验有效，才有必要对样品进行分析。如果阳性对照没有出现S型扩增曲线，则说明试剂盒可能失效，实验无效。如果阴性对照有S型扩增曲线，则说明LAMP引物设计得不好，有非特异扩
    增，需要重新优化引物。也可能是环境或试剂有污染，实验无效。遇到实验无效的情况，请跟厂家客户联系，分析原因后再恢复实验。
    
12. 如果实验有效，则分析样品。凡是有S扩增曲线的，可以判断为阳性。凡是没有S扩增曲线的，可以判断为阴性。典型的荧光检测结果见下图。左边为阳性结果，扩增曲线为S型，右边为阴性结果，扩增曲线不呈S型。
    
    
13. 当实时荧光检测和可视化检测同时使用时，如果不一致，以实时荧光LAMP的数据为准。一般可视化结果滞后实时荧光检测结果20～30分钟，也就是说，在qPCR仪上第30分钟时呈现阳性的样品，其颜色变化在第50～60分钟时才能观察到。